2.1.2 MATERIALY EQUIPO DE LABORATORIO

EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES (CTV)

MATERIALES E INSTRUMENTAL

 Para el desarrollo de la investigación y docencia, en el campo del cultivo de tejidos, se requieren de materiales que permitan la preparación de fórmulas nutrimentales con el objetivo de cultivar tejidos, órganos y células vegetales in vitro . Ya se que ustedes organizaran esta informacion por área y sus materiales yequipo, yo lo abordare de manera mas global y aqui se tratará  entonces de enumerar cuales son los aparatos y cristalería que son más comúnmente utilizados para el cultivo de tejidos vegetales y aunque es claro que existen más y no se mencionaran. A continuación se presentarán los diferentes materiales que se encuentran en un laboratorio que desarrolla actividades en el campo mencionado.

CRISTALERÍA

 La cristalería de uso más común para el cultivo de tejidos se selecciona de la que se utiliza en experimentos químicos o de microbiología; sin embargo, poco de este material está diseñado especialmente por investigadores. Se utiliza bastante material de vidrio en la preparación de medio de cultivo y en la siembra de tejidos vegetales. El material que se seleccione deberá ser de alta calidad, resistente a altas temperaturas y a ácidos y no liberar sustancia alguna, especialmente aquélla que es utilizada en la conservación de soluciones madres.

TUBOS DE ENSAYO

 Se utilizan muy frecuentemente en cultivos con pequeñas cantidades de soluciones o bien para diversos tipos de medios. En cultivos que se mantienen en rotación o en agitación, para los medios líquidos, se utilizan tubos de ensayo, así como también en los medios sólidos. Los tubos de ensayo utilizados para cultivo de tejidos son más cortos y más anchos. Normalmente las dimensiones de los tubos de ensayo son de 2.0 x 15.0 cm, 2.5 x 15.0 cm o de 2.5 x 9.0 cm, aunque en el cultivo de órganos (experimentos sobre inducción de órganos) a partir del cultivo de tejidos y en la inducción floral se emplean tubos específicos que son de mayor longitud y diámetro (2.5 x 20.0 cm). Para cubrir la boca los tubos de ensayo, una vez que se les ha cultivado, se usan los materiales siguientes: algodón no absorbente, papel aluminio o de poliestireno, poliestireno K-resina, tapas de plástico, tapones de hule y de polipropileno.

MATRACES ERLENMEYER

 Estos matraces se usan para preparar medios de cultivo sólidos o líquidos; en la preparación de medios de cultivo. Se usan matraces de capacidad de 50, 125, 300 y 500 ml; de 1 y 2 litros dependiendo del volumen de trabajo, se tendrá la cantidad requerida de matraces. Para cultivo en matraces son más fáciles para su manejo los de 50 y 125 ml de capacidad; cuando los matraces y los tubos de ensayo tienen un mismo diámetro, se facilita más el hacer tapones para cubrirlos. Un diámetro de 25 mm es suficiente para operar dentro de ambos. Aunque por supuesto, en el cultivo masivo de tejidos, tanto en medio sólido como líquido, se requieren dimensiones más grandes en los matraces.

 CAJAS DE PETRI

Las cajas de petri no sólo se utilizan para hacer cultivos en medios sólidos, también para germinar semillas esterilizadas o bien para esterilizar tapones de hule, filtros de nylon o de acetato de celulosa, que se usa para esterilizar soluciones orgánicas e inorgánicas y para guardar papel filtro.

Comúnmente se utilizan cajas de petri de 6, 9 y 12 cm de diámetro. Para la germinación de semillas son más convenientes las de mayor anchura. Estas cajas de petri deberán tener un ajuste firme entre la tapa y tapa. Generalmente se emplean cajas petri de vidrio, aunque en la actualidad se están fabricando de polipropileno. Estas son deshechables.

BOTELLAS PARA CULTIVO

Para propósitos de cultivar plantas en condiciones in vitro, se utilizan botellas cilíndricas o cuadradas, que pueden ser las botellas de whisky, ron, brandy, etc., que son resistentes a altas temperaturas y que son muy apropiadas para los medios de cultivo sólido. Generalmente tienen una tapa rosca y se les puede conservar fácilmente en una posición vertical u horizontal. Las botellas cuadradas pueden colocarse unas sobre de otras, de tal forma que no ocupen mucho espacio, y las cilíndricas no requieren de canastillas especiales para guardarse. Uno de los recipientes más empleados para el cultivo de tejidos es el frasco para alimento de bebes (Gerber) que aparte de ser útil, es fácil de conseguir, muy barato y no ocupa mucho espacio en la cámara de incubación. En algunas casas comerciales pueden conseguir recipientes de polipropileno o de policarbonato, que además de ser práctico requieren de poco espacio; sin embargo, tienen el inconveniente de tener un costo alto. La condición más favorable es tener el costo más bajo posible tanto en lo referente a investigación, enseñanza y obviamente cuando desarrollamos tecnología para fines comerciales.

BOTELLAS PARA REACTIVOS Y SOLUCIONES MADRE

Se requieren muchas botellas de polipropileno de 50 ml, 100 ml, 500 ml para guardar soluciones madre o para hacer soluciones de varios reactivos. Las botellas oscuras son usadas para evitar la multiplicación de hongos y bacterias o oxidación causadas por la luz. Las botellas de polipropileno como se utilizan para conservar bajo congelación compuestos de composición indefinida, como el agua de coco, soluciones hormonales o compuestos orgánicos termoinestables.

PIPETAS, GOTEROS, PROBETAS Y MATRACES
Para la preparación de diversas soluciones para la elaboración de los medios básicos para el cultivo de tejidos vegetales se requiere de la cristalería siguiente:

            Pipetas graduadas: de 1, 2, 5 y 10 ml

            Goteros con pera de goma de 10 ml
            Probetas graduadas: de 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 ml
            Matraces volumétricos: de 500 y 1000 ml
            Matraces aforados: de 50, 100 y 250 ml

 VASIJAS DE VIDRIO PARA LA DISTRIBUCIÓN DE MEDIO DE CULTIVO

Para la distribución de un volumen de medio de cultivo se pueden usar diferentes formas, por ejemplo vasijas de vidrio, embudos grandes con tubos de hule y pinzas de compresión, columnas de vidrio con boca de salida o botellas de inyección de Linger o simplemente recipientes de aluminio, como jarras. Cuando por alguna razón no se cuenta con los accesorios adecuados para servir el medio de cultivo, como improvisación se usa el embudo grande de vidrio con tubo de hule en el extremo del tallo y pinzas de compresión para controlar el volumen de salida del medio de cultivo.

INSTRUMENTOS Y APARATOS

Para el cultivo de tejidos hay pocos aparatos e instrumentos diseñados especialmente para este propósito. Sin embargo, se pueden escoger varios instrumentos médicos, así como también muchos aparatos de microbiología.

 FILTROS Y ESTERILIZADORES

Recientemente se han usados membranas de éstercelulosa para propósitos de esterilización de líquidos. Se tienen muchos tipos de membranas de acuerdo al tamaño de los poros. Para esterilización se deben escoger aquellos que tengan poros de menor tamaño que 0.25 micras. Estas membranas se consiguen en el mercado con el soporte y otros aparatos adaptables. Se les conoce bajo varios nombres como: Filtro Millipore, Filtro Galman de membrana, Filtro Toyo de membrana, etc.

Normalmente estos filtros se pueden esterilizar en autoclave a una atmósfera de presión durante 15 min., la esterilización por más tiempo o esterilización seguidas no afecta la membrana. Se sugiere que al utilizar estos filtros de membrana se sigan las recomendaciones indicadas por los fabricantes.

CÁMARA DE FLUJO LAMINAR

Para la realización de investigación y docencia en un laboratorio de cultivo de tejidos se requieren condiciones de asépsia, por lo que se emplea la cámara de flujo laminar que inyecta el aire ultrafiltrado y esterilizado que permita la manipulación de los tejidos sin que se presenten problemas de contaminación por microorganismos como hongos y bacterias, no solamente cuando se hace la inoculación, sino cuando se sirve medio de cultivo a frascos que, por motivos de la técnica, se tengan que esterilizar previamente. De acuerdo al flujo del aire, las cámaras son horizontal o vertical y se tienen tres presentaciones, en cuanto al tamaño; 0.60m, 1.20 m y 1.80m. Algunas veces se encuentran complementadas con llave para gas y para extracción de aire (vacío).

  HORNOS PARA SECADO

Estos hornos se usan especialmente para el secado del material de vidriería lavado y para la esterilización de instrumentos usados para el cultivo. Para la esterilización por secado, la temperatura que se debe conservar es de 140°C durante 4h o bien a 150°C – 180°C por una hora, por lo que se requiere de un termostato que sea preciso. Sin embargo, la esterilización por este proceso no es recomendable para cristalería de medición de precisión, como probetas, pipetas, debido a que el vidrio sufre dilatación por el calor, lo que altera los volúmenes que se miden.

Las pesadas en seco de células o tejidos cultivados se hacen después del secado al vacío en un horno de vacío. Para este propósito muchas compañías venden eléctricos de vacío con termostato.

AUTOCLAVES
Las autoclaves esterilizan con vapor de presión y tienen dos sistemas de calentamiento: a base de gas o de electricidad. Los modelos de autoclave son de tipo horizontal o vertical.

La esterilización de algodón, gas, papel para envoltura (aluminio, manila), filtros Seitz, millipore, pipetas probetas, matraces aforados, agua y medio de cultivo se hace en autoclave.

REFRIGERADOR Y CONGELADOR

Células, tejidos y soluciones madres, se deben de conservar a bajas temperaturas y para ello se requiere un refrigerador. Por otro lado, algunas de las vitaminas o compuestos de composición química indefinida, como el agua de coco, requieren de ser mantenidas en congelación, sobre todo en aquellos lugares de clima cliente. Para experimentos en pequeña escala, un refrigerador común con un pequeño congelar es suficiente.

BALANZAS

La preparación del medio requiere de realizar el pesaje con precisión de todos los componentes que lo integran con precisión y de acuerdo al tipo y a la cantidad del constituyente que se agregue al medio, así será el tipo de balanza que se emple. Existe una gran diversidad de este equipo, sin embargo, hay dos tipos de balanza que son muy usuales en el laboratorio: granatarias y analíticas, ambas de precisión

TORSIÓN O  GRANATARIA
Las balanzas granatarias más frecuentes son:
-De doble y triple barra
-Electrónica con platillos superior

Las balanzas de torsión tienen una capacidad de 100 a 200 g, y sirven para pesar en gramos de sustancias    químicas o células cultivadas. La precisión de 0.1g, es suficiente para estos experimentos.

 BALANZAS ANALÍTICAS

En el mercado se tienen diferentes modelos, sin embargo, por lo menos existen 3 tipos de aparatos:

 - De platillo metálico, cuyo sistema de pesaje depende de material de cuarzo

- Electrónica con platillo fijo en el interior del equipo

-.Electrónica con el platillo en el exterior del aparato

Estas balanzas tiene una capacidad de 100 a 160g, y una precisión de 0.1mg, lo cual es muy útil para pesar cantidades pequeñas de hormonas, vitaminas y otros microelementos.

CUIDADOS

Para lograr un pesaje adecuado sobre todo exacto, se deben observar algunas precauciones indispensables para su buen funcionamiento, como son:

 -           Las balanzas deben estar colocadas sobre una mesa estable, dura y nivelada que impida que las vibraciones y corrientes de aire afecten las pesadas.

-           Deben estar ubicadas en un lugar limpio

-           Nunca deben estar sobrecargadas

-           Nunca debe pesarse directamente sobre el platillo; para tal efecto hay que emplear recipientes ligeros o papel.

-           Checar continuamente que la balanza este nivelada. En el caso que no lo esté, centrar la burbuja con el nivel del aparato.

-           Evítese desplazarlas del lugar donde fue ubicada en el área de balanzas, de manera que no se afecte su mecanismo.

MEDIDORES DE pH
Para ajustar el pH de los medidores de cultivo se utilizan indicadores de papel y químicos, pero lo más conveniente es usar un potenciómetro con electrodos de vidrio. El potenciómetro no sólo se usa para medir el pH de los medio al prepararse, sino también para medir el pH de los medios durante el período de incubación. Recientemente se usan aparatos con control automático de pH para los cultivos en suspensión.

DESTILADOR

El agua exenta o con una cantidad mínima de metales pesados es una condición primordial en el cultivo de tejidos vegetales, Muchos investigadores utilizan agua bidestilada o tridestilada, hecha en destiladores de vidrio de alta calidad o bien combinado el proceso de destilación por ósmosis inversa y desmineralización. La preparación. La preparación de soluciones madre, medios de cultivo, lavado de cristalería, etc., requiere de grandes cantidades de agua, por lo que es necesario tener un destilador grande de metal, tomando en cuenta que el agua obtenida  así, contiene una pequeña cantidad de iones de metales pesados, condición que afecta el desarrollo de las células en cultivo. Para la obtención de agua también se puede usar un desionizador después de haberse obtenido el agua en un destilador metal.

Adicionalmente, si se necesita agua completamente exenta de sales, se debe redestilar en su destilador de vidrio de alta calidad.

 AGITADOR MAGNÉTICO

Este es un aparato fundamental para la preparación de los medios de cultivo. Su uso permite la mezcla de los constituyentes del medio durante la elaboración de las soluciones madre o bien en la preparación del medio definitivo. También existen diversos modelos, pero su funcionamiento se limita a dos aspectos, agitar, lo cual permite mezclar el soluto con el solvente y con sistema de calentamiento, lo que facilita la disolución de algunos compuestos que requieren calor para entrar en solución. El número de revoluciones oscila entre 60 hasta 1800 rpm. El número de plazas varia de acuerdo al modelo, pero los hay desde un espacio hasta 6.

Complementariamente, se emplean barras magnéticas que son las encargadas de realizar la agitación de las substancias. Las hay de diferente tamaño y diámetro; con o sin costilla.