Componentes de un medio de cultivo:
• Sales inorgánicas
• Fuente de carbohidratos
• Reguladores de crecimiento
• Vitaminas
• Aminoácidos
• Complejos organicos
• Reguladores de crecimiento vegetales
• Antioxidantes
• Material de soporte
• Agua
El éxito de la aplicación de la tecnología del cultivo de tejidos in vitro depende del grado de entendimiento de los requerimientos nutrimentales que tienen las células, tejidos u órganos. No obstante, el éxito o fracaso está relacionado con el origen o naturaleza del inóculo (meristemos, embriones, raíces, anteras, hojas, ovarios, protoplastos y células en suspensión, callos y endospermo).
Puche y Rodriguez (2000) mencionan que “Haberllandt (1902) estudió el efecto de los componentes inorgánicos en el crecimiento del girasol y tejidos tumorosos de tabaco; según Burkholder y Nickell (1949) el efecto de los iones inorgánicos en agallas de acedera y Nitsch y Nitsch (1956-1957) muestran que las sales inorgánicas reducen el crecimiento del girasol tuberoso remolacha azucarera, De acuerdo a los efectos mayores o menores que causen en los tejidos, podemos distinguir que un medio de cultivo está formado por componentes esenciales y no esenciales. Se consideran esenciales a la mezcla de compuestos químicamente definidos y que se ha denominado como medio basal o sintético y está constituido por una parte inorgánica y otra orgánica; los elementos inorgánicos combinan macroelementos con microelementos y la parte orgánica está formada por una fuente de carbono y energía, vitaminas aminoácidos y reguladores del conocimiento. Adicionalmente se emplean compuestos naturales de composición no definida y sustancias anitoxidantes”.
NUTRIMENTOS INORGANICOS
Los minerales son muy importantes en la vida de la planta; para un crecimiento sano y vigoroso se requiere de la presencia de compuestos inorgánicos que se agrupan en macro y micronutrimentos.
Macronutrimentos
Son los que se requieren en cantidades de milimoles y son los elementos requeridos en mayor cantidad, (carbono C), oxígeno (O) e hidrógeno (N), aminoácidos, Vitaminas, proteínas y ácidos nucleicos.
Comúnmente se adicionan como nitrato o amonio y menos usual como nitrito. El nitrito se añade en concentraciones de 25-40 milimoles y el amonio de 2 a 20 milimoles (Gamborg y Jerry, 1981) fósforo (P) empleado casi universalmente en forma de fosfatos; sin embargo, la alta concentración de fosfato en solución puede detener el crecimiento, azufre (S) como sulfato y con la posibilidad que se agregue en forma de sulfito o como sulfuro, pero con menos efectividad (Nitsch y Nitsch, 1969). Como fuente de azufre, además de los sulfatos, sulfitos, se encuentran la cisteína, metionina o glutation. La deficiencia de azufre da por resultado una etiolación; magnesio (Mg) es componente fundamental de la molécula de clorofila; el calcio (Ca) es parte importante integral de la membrana celular, además confiere protección a la membrana contra los efectos deletéreos de los metales pesados, salinidad y pH muy bajos; usualmente se adiciona como cloruro de calcio (CaCl2 2H2O)m nitrato de calcio (Ca (NO3)2) y menos comúnmente como fosfato tricálcico ( Ca 3 PO4); fósforo y el potasio como el catión mayor y se adiciona en la forma de KNO3, KI, KCI Y K2 PO4. En términos general fósforo, calcio, magnesio y azufre son requeridos en concentraciones de 1 a 3 milimoles para un buen crecimiento. Sin embargo, existe un antagonismo entre el Ca² y el Mg². Cuando la concentración de Mg²+ es alta, se requiere también alta Ca²+. La concentración comparativa es a menudo más importante que la concentración absoluta de iones.
Micronutrimentos
Según Puche y Rodríguez (2000), Los micronutrientes o elementos menores se añaden en concentración micromolar. Los elementos menores son seis, a saber: Fierro (Fe), zinc (Zn), manganeso (Mn), cobre (Cu), cobalto (Co), boro (B) y molibdeno (Mo) que forman parte de la estructura de algunas proteínas vegetales, o vitaminas de interés bioquímico-fisiológico. De los 6 elementos, el Zn, Mn, Fe, Cu y Mo intervienen en la síntesis de la clorofila y en la estructura del cloroplasto (Sundqvist et al, 1980). El manganeso es considerado como uno de los más esenciales, junto con el boro y el fierro; además tiene importancia de la fotosíntesis en donde interviene en la conservación de la ultraestructura de los cloroplastos. De acuerdo a Galston y Hillman (1961), el Mn es un cofactor de las enzimas peroxidasa que permiten la oxidación del ácido indolacético en las células vegetales. Doershug y Miller (1967) mencionan que la omisión reduce el número de brotes en cotiledones de lechuga. Asimismo su adición en alta concentración puede compensar la carencia del Mo en raíz de jitomate (Hannay y Street, 1954). En ocasiones el manganeso puede remplazar al magnesio, en algunos sistemas enzimáticos (Hewitt, 1948).
El zinc, particularmente, participa en el desarrollo normal del sistema radical del jitomate (Eltinge y Reed, 1940). Cobre forma parte de enzimas oxidasas que están involucradas en la oxidación e hidroxidación de compuestos fenólicos, ácido abscísico y dopamina (Lerch, 1981). El fierro y molibdeno juntos forman parte de la estructura de las enzimas nitrogenasa y nitrato reductasa (Lerch, 1981). Algunas veces el Zn se añade con un quelato (EDTA).
El boro tiene su efecto más importante en inducir el crecimiento del tejido diferenciado e indiferenciado. En dicotiledones, la deficiencia de boro frecuentemente permite un aumento en el crecimiento de cambium; asimismo, la deficiencia propicia una depresión de las citocininas lo que trae como consecuencia un incremento en la concentración endógena de las AUXINAS y de tal manera que en un sistema de raíz deficiente de boro, aparentemente hay una inhibición de la raíz por un exceso de auxina (Odhnoff, 1957, Whittington, 1959).
El cobalto se encuentra en la estructura de análogos de la vitamina B₁₂ que es involucrada en la síntesis de los ácidos nucleicos (Fries, 1962). El fierro es requerido para la formación de ácido aminolevulínico y protoporfirinógeno que son precursores temprano y tardío de la clorofila, respectivamente; además es un componente de las proteínas ferredoxinas cuya función es como transportador de electrones en fotosíntesis.
El fierro se usa como FeSO4 o FeCl2, pero en valores superiores de pH 5.2 se precipita como Fe(OH)2, tal como ocurre en el cultivo de raíz de jitomate, ocasionando deficiencia de fierro. En el cultivo de tejidos no se observó deficiencia de Fe, por lo que algunas sustancias, como quelatos pudieron penetrar en las células.
El tartrato férrico a pH 6.0 y el EDTA-Fe a pH 7.2 son en la forma en que se les usa. En medios líquidos, el citrato férrico o el tartrato férrico es utilizado en lugar del FeCl₃. Recientemente investigadores utilizan el Fe en forma de citrato, tartrato o de EDTA-Fe.
En los inicios de los experimentos del cultivo de tejidos, fue incierta la naturaleza de los microelementos esenciales; sin embargo, Knudson (1922) incorpora el Fe y Mn exitosamente para la germinación de semillas de orquídeas no simbióticas. Otros elementos menores agregados al medio Nobecourt (1937) fueron Cu, Co, Ti, y Be. Heller (1953) observa la deficiencia de los minerales, en callos de zanahoria previamente crecidos en medio Gautheret, causa la muerte del tejido, cuando se hacen 3 a 5 transferencias a un medio sin Fe, B, Mn, Zn o Cu. En el cuadro 1, se presenta la concentración de los componentes, tanto macro como micronutrimentos, de diferentes medios de cultivo.
Complementos orgánicos
Se consideran complementos microorgánicos a los compuestos orgánicos que se han llamado así por que el crecimiento y en general la morfogénesis se ven mejorado.
Los complementos microorgánicos se agrupan en:
Vitaminas
Aminoácidos
Complejos naturales de composición química indefinida
Reguladores del crecimiento
Vitaminas
Las vitaminas son consideradas como factores alimenticios secundarios requeridos por los animales en pequeñas cantidades. Sin embargo, estas sustancias, que normalmente sintetizan las plantas, son también empleadas por ellas para su crecimiento y diferenciación con papeles catalíticos en el metabolismo. Cuando las células de plantas superiores son cultivadas in vitro , las vitaminas son necesarias para el crecimiento llegando a ser su ausencia o nivel de concentración, un factor limitante. No obstante, estas necesidades dependerán de la especie. Las vitaminas que son adicionadas más usualmente como parte del medio sintético son: tiamina-HCl, ácido nicotítico, piridoxina-HCl, biotina, ácido fólico, ácido pantoténico, riboflavina.
Generalmente, los requerimientos de las células, tejidos u órganos vegetales de vitaminas, son cubiertos por la adición externa, sin embargo, los tejidos pueden obtenerlas a partir de los complejos orgánicos de composición indefinida como en agua de coco, extracto de levadura, jugos de frutas, aguamiel. Aún cuando las plantas in situ son capaces de sintetizar sus propias vitaminas-Butenko (1986) menciona que tejidos de zanahoria pueden llegar a habituarse.
Tiamina (B1)
La Tiamina es esencia para el crecimiento. Es fotoestable, pero durante la esterilización por autoclave se descompone en pirimidina y tiazol; sin embargo, la mayoría de los tejidos son capaces de sintetizar tiamina a partir de los productos de su descomposición. En la naturaleza, especialmente los cereales aparecen libre y en concentraciones relativamente elevada.
Piridoxina (B6)
Es termo y fotoestable. Se localiza en semillas de cereales y no se considera esencial para la mayoría de las plantas in vitro.
Quizá el papel más importante en su participación, bien conocida, en la síntesis de purinas y pirimidinas y por lo tanto en el metabolismo de los ácidos nucleicos.
Acido nicotinico
También se le llama niacina. Es foto y termoestable. Su principal función es ser coenzima de las enzimas que se conoce como deshidrogenasas que catalizan las reacciones de oxido-reducción (NAD, NADP Y NADH o NADPH).
Riboflavina
Es termoestable, pero fácilmente se descompone a la luz. A bajas concentraciones (90.01 mg.l-l) promueve el crecimiento en callos habituados de zanahoria, pero sin efecto en la oscuridad. Concentraciones de 10-50mg.l-1 inhiben completamente el crecimiento en la luz y promueve el crecimiento en la oscuridad (Butenko, 1968). La riboflavina aparece en la naturaleza como un constituyente de las flavinas coenzimas: flavin mononucleotido (FMN) y flavin adenina dinucleótida (FDA). La riboflavina es termoestable por lo que no se descompone fácilmente (cuadro 1-3). Galston, Bonner y Baker (1953) señalaron que las diferencias de crecimiento en la luz y oscuridad de brotes blanquiscos o etiolados de chícharo eran causados por la activación del AIA por la riboflavina.
Acido pantotécnico
Es termoestable, por lo tanto, puede ser esterilizado en autoclave junto con el medio nutricional Estimula el crecimiento de levaduras, en sauce llorón y Juniperas (Morel, 1946; Gautheret, 1958). Se encuentra en la naturaleza como componente de la coenzima A. Sin embargo, no es una vitamina esencial.
Biotina
No es esencial y probablemente promueve el crecimiento del cambio en inóculo de sauce llorón (Gautheret, 1959). La biotina sirve como factor de crecimiento de las levaduras y algunas bacterias. Unida a su enzima específica, se relaciona íntimamente con reacciones de carboxilización.
- carboxilación
- carboxilación conjugada y transcarboxilación
Acido fólico
No es esencial y se descompone con el calor en soluciones ácidas. En la oscuridad inhibe el crecimiento de los tejidos, mientras que en la luz lo promueve. Reinert y White (1956) mostraron que el ácido fólico inhibe el crecimiento de tejidos de pino. Se considera como vitamina en función de coenzima.
Aminoácidos
Los aminoácidos representan, para las células, una fuente efectiva e inmediata de nitrógeno, puesto que se pueden incorporar al metabolismo mucho más rápido que el nitrógeno inorgánico, aún cuando ambas fuentes se encuentran en el mismo medio (Thom et al., 1981), sin embargo, su incorporación al medio de cultivo es bastante discutido. Es conocido que su empleo esta en función del balance adecuado de la relación NH4/NO3 que es usualmente suministrado como NO3-, NH4, NO3, NH4Cl, etc. Generalmente la inclusión de estos compuestos nitrogenados orgánicos es necesaria solamente cuando se inicia la formación de callo, se consideran como estimulantes o requeridos durante la proliferación celular (Gamborg y Jerry 1981). Tienen efecto notable sobre el desarrollo de tejidos vegetales cuando son usados en combinación, mientras que empleando uno solo no se muestra afecto. Alguno tiene efecto antagónico entre ellos, así es el caso de la fenilalamina y tirosina (Anderson, 1976), la leucina y valina, la isoleucina y valina , la arginina y lisina sobre el crecimiento de raíz del embrión de la avena bajo cultivo. En tejido de tabaco el efecto antagónico se observa con la isoleucina, valina y treonina.
Los aminoácidos son usados como constituyentes de compuestos de composición química indefinida o bien por adición directa. De esta manera, se encuentran en caseína hidrolizada, peptona, triptona, lactoalbúmina hidrolizada, extracto de malta, agua de coco, casamina, etc. Los aminoácidos que se emplean directa y más comúnmente son L-glicina, L-glutamina, L-asparagina, L-arginina, L-prolina, ácido glutámico. L-hidroxiprolina, L-alanina, L-lisina, L-leucina, L-serina y L-cisteina. Nitsch y Nitsch (1957) señalan que las formas L de los aminoácidos son más adecuadas para el cultivo de tejidos que las formas -D ya que estas son tóxicas. Además, las formas racémicas son mejores para el desarrollo de tejidos que las formas puras -L de aminoácidos. Se han señalado efectos diferentes al usar isómeros de aminoácidos, por ejemplo: -L alanina es más fácilmente asimilado que la B-alanina. El ácido α aminobutírico no puede ser utilizado como fuente de nitrógeno, pero puede remplazar completamente a los nitratos.
La inhibición del crecimiento por algunos aminoácidos sólo ocurre por causa de inhibición sintética del nitrato reductasa. Este crecimiento puede ser recuperado usando arginina como el aminoácido desnhibidor, la arginina tiene también efecto de restablecer el crecimiento de raíces inhibidas en compuestas; además de acelerar la formación de yemas en tejidos de tallo de tabaco. La urea también puede ser usada como una fuente de nitrógeno, en vez de aminoácidos. Aún cuando la mayoría de los investigadores señalan que si el medio de cultivo tiene la fuente de amonio o nitrato adecuado, los aminoácidos no son esenciales (Gamborg, et. al.,1976). También es cierto que la adición posiblemente depende del origen del tejido; además de que su incorporación es requerida para diversos objetivos. De acuerdo con Steward y Caplin (1951), la glicina o mezcla de aminoácidos en forma de caseína hidrolizada se requieren para el mantenimiento de células indiferenciados (callo). Murashige y Skoog (1962) Gamborg (1966) señalan que la adición de la caseína hidrolizada incrementa la división celular en tabaco, frijol y maíz, respectivamente. Nitsch et. al. (1970) confirma que agregar nitrógeno en forma de NH₄⁺ estimula el crecimiento de callo en pera o manzana; pero aumenta cuando el medio se complementa con asparagina, glutamina u otro aminoácido.
A pesar de que la presencia de nitrógeno orgánico es muy importante para la organogénesis, se considera esencial para la embriogénesis. Además de la caseína hidrolizada, la L-glutamina ha demostrado ser promotor del desarrollo embrionario. En ocasiones, puede sustituir a la caseína hidrolizada (Litz, 1982). Filner (1978) indica que en células XD de tabaco, el nitrógeno orgánico, particularmente la arginina actúa positivamente en la síntesis de proteínas. En embriones inmaduros de vainilla, el aceleramiento de la maduración es estimulada por la adición al medio de sulfato de adenina y L-glutamina (Parra y González, 1989 y González et. al. 1990)
Es difícil definir si el papel de los aminoácidos es esencia o no; sin embargo, la adición de la caseína hidrolizada puede prevenir o inclusive asegurar la fuente de nitrógeno, ante la posible deficiencia de la fuente de amonio o nitrogeno inorgánico o como Li et. al., (1989) señala que la ausencia de aminoácidos, principalmente prolina, ocasiona degeneración de plántulas de Pachystachys lutea cultivadas in vitro.
Carbohidratos
La sacarosa y la glucosa se utilizan en el cultivo de tejidos de muchas especies. La fructuosa, maltosa, celabiosa, rafinosa y otras, se les usa como fuente de carbono para algunas variedades de tejidos. Para la mayoría de los tejidos en cultivo es sacarosa la mejor fuente de carbohidratos (2-5%), de manera que el máximo aumento en peso fresco en los tejidos cultivados del endospermo del sorgo se obtiene con 2% de sacarosa, y el máximo de peso seco a 8%. Varios informes señalan que la sacarosa se hidroliza activamene a fructuosa y glucosa por la invertasa de la pared celular. Así por ejemplo, la sacarosa, callosidades de zanahoria, desaparece del medio de cultivo en dos días. La dextrina, pectina y almidón son aprovechados por la callosidades de Sequoia y el almidón soluble es aprovechado por callosidades del endospermo del maíz o de Juniperus. Las carbohidrasas hidrolizan el almidón, maltosa o rafinosa en monosacáridos.
La combinación de algunos carbohidratos no son útiles para el crecimiento de tejidos vegetales como fuente única de carbono. Los ácidos orgánicos más efectivos, como el ácido succínico, ácido cítrico y ácido fumárico, desarrollan sólo de un 25 a 50% del crecimiento comparado con un tejido cultivado en el cual la fuente de carbono es la sacarosa Bouriquet (1958) sugiere que los ácidos orgánicos actúan sinergéticamente a bajas concentraciones del 2,4-D.
Reguladores del crecimiento
Los reguladores de crecimiento se dividen en auxinas, citocininas, giberelinas y retardantes e inhibidores del crecimiento y son naturales y sintéticas.
Auxinas naturales
De acuerdo con su naturaleza, el ácido indolacético (AIA) es la única auxina natural que se localiza en las zonas de crecimiento. Tiene la peculiaridad de ser descompuesto por la luz, por lo que no es conveniente utilizarlo en cultivo en suspensión. Por ser hormona natural, su desaparición del tejido es muy rápido ya que en las plantas se encuentran las enzimas oxidasas de la que hidrolizan a la hormona de manera que su efecto es suave y de poca duración.
Auxinas sintéticas
Son auxinas sintéticas del ácido naftalenacético (ANA), ácido 2,4 diclorofenoxiacético y ácido indolbutírico (AIB). La primera y la tercera hormona forman parte de los productos que se utilizan como enrizadores.
Los tejidos aislados de plantas y las callosidades en subcultivos, requieren de auxinas. Los que no las requieren son los callos habituados y los tejidos tumorales. Para el cultivo de callosidades se usan de 0.1 a 5.0 mg/l de AIAy para la diferenciación de órganos se ha señalado a menudo que es necesario reducir la concentración de la auxina. El AIA o el ANA son mejores que el 2,4-D para la inducción de la organizacióncelular. Si se usa 2,4-D en muchas especies de plantas trendrán la tendencia a la formación de callos, por lo que si se desea inducir la formación de órganos, se necesita cambiar el 2,4-D por otra auxina como el AIA o bien bajar la conentración.
Citocininas
Citocininas naturales son:
Zetina que se extrae del endospermo del maíz y 6 issopentanil adenina (2iP) que se aisla de Clostridium Tumerfaciens que produce un sobre crecimiento de los tejidos. Algunos tipos de tejidos requieren esencialmente citocininas, principalmente en el fenómeno de la organogénesis; por ejemplo, los callos de soya o de la médula de tabaco (var Wisconsin #38). Sin embargo, no todos los tejidos requieren citocininas, aunque algunas crecen bien en su presencia, éstas no son esenciales.
Citocininas sintéticas son: 6-benciladenina (6 BA) o también conocida como bencilanimopurina (6 BAP); la cinetina (K) también conocida como 6-furfiril aminopurina (FAP). La 6-benciladenina se utiliza en concentraciones de 1.01-1.0 mg/l. También se emplea la zeatina o isopentil adenina como sustancias de naturaleza citocinética.
Acido giberélico
El ácido giberélico no se usa conúnmente para el cultivo de callo. En ocasiones se adiciona al medio para inducir alargamiento del tallo, pero no es común su uso.
Acidos nucleicos y compuestos con base de ácidos nucleicos
El ADN, ADN hirolizado no tiene efecto en tejidos bajo cultivo, pero el ERN estimula el crecimiento de callos de tabaco, maravilla y Rumex el efecto del ARN puede ser demostrado en presencia de citocinas.
El uracilo, citosina, guanina, xantina y timina no son efectivos para los callos de zanahoria. Sin embargo, la cinetina y el extracto de zanahoria, que tiene actividad de citocinina, tienen el efecto de estimular el crecimiento cuando se usan con una mezcla de aminoácidos. Por otro lado, la guanina, timina y citosina inducen la formación de organos en tejidos de tabaco. La mezcla de una citocinina y ácido orótico induce el desarrollo de la inflorecencia de Plumbago índica.
Substancias naturales
Las substancias naturales de las plantas ampliamente usadas son: de agua de coco (10-20%), extractos de levadura (EL) y se emplea en concentraciones de 0.01-0.05%, caseína hidrolizada (CH) se emplea desde 0.01% a 1.0% y extracto de malta (EM) que se adiciona desde 0.1 –0.5% también se usa peptona, jugo de tomate, pepino, del endospermo inmaduro de maíz y ácido casaamino.
Estas sustancias son por lo general, termoestables. La adición del endospermo inmaduro de coco a los medios nutrimentales promueve el crecimiento de tejidos de diversas plantas. Cuando se usa extracto de levadura se debe tener cuidado en las diferentes calidades de los extractos, ya que de estos depende la certeza de los datos. En el caso del ácido casaamino, el efecto de éste podrá definir si es por hidrólisis ácida por descomposición enzimática. De las sustancias naturales de plantas, se analizó el agua de coco. Las sustencias efectivas son estables y se les dividió en relación a sus principales componentes, en tres fracciones; mezca de aminoácidos y amidas; mío inositol y d-sorbitol en la fracción neutral y la difenil urea y leuco antocianina en la fracción activa, las cuales a su vez están unidas por carbones activos. El efecto del agua de coco es el resultado total de estos tres. Sin embargo, el agua de coco es una mezcla muy compleja cuyos componentes y concentraciones son muy variables, dependiendo de la estación del año y sitio de la colecta. Del endospermo inmaduro de maíz se aislan la zeatina, una de las citocininas, que puede ser un acelerador en el endospermo. La actividad de esta citoocinina también se encuentra en semillas inmaduras de lupino, en extracto de levadura y agua de coco.
Agar
El agar es un gel que se extrae de algas marinas y que por sus características físicas se emplea para solidificar el medio básico, cuando ses trabaja con cultivo estsacionario sólido o semi-sólido. Un buen agar es aquel que:
a. Hierve a 100 °C y que solidifica a 45 °C, aproximadamente. Esta característica le confiere estabilidad a cualquier temperatura de incubación.
b. No es digerido por enzimas vegetales.
c. No reacciona con los constituyentes del medio de cultivo
Hay diferentes grados o tipos de agares y generalmente se le considera como buen soporte del inóculo; sin embargo, datos proporcionados por compañías elaboradoras de agar comercial consignan que contiene pequeñas cantidades de tiamina, biotina y minerales, por lo que no es conveniente utilizarlo indiscriminadamente. Al respecto, White (1953) sugirió que el agar tiene un papel mutrimental, de tal manera que aporta y los tejidos son capaces de utilizar.
Romberger y Tabor (1971) consideraron que mientras sea menos puro, se pueden encontrar iones, polisacáridos sulfanatados, ácidos grasos de cadena larga, que son capaces de inhibir el crecimiento bacteriano, pero que aún se desconoce que efecto puede inducir en tejidos vegetales. Existen indicios que el vigor y peso seco se incrementa cuando se usa Difco agar purificado, comparativamente al empleo de Difco Noble agar o Difco bacto agar, éste produce resultados intermedios. De acuerdo a Debergh (1983), el agar puede contener Ca, Mg, K y Na (cuadros 1-6 y 1-7) de manera que se altera la formulación nutrimental del medio de cultivo. Es posible que para el caso de la micropropagación comercial no sea requerido el agar altamente purificado y de esa forma abaten los costos. La concentración de agar en los medios de cultivo sólidos es variable y depende de la calidad , pero usualmente es de 0.7-1.5%. Los medios que tienen altas concentraciones de sales requieren de un porcentaje alto de agar. Dependiendo de la concentración del agar y el pH, será la dureza del medio. Cuando el medios es duro, el crecimiento del inóculo se hace muy lento. Por otro lado, diversos estudios señalan que concentraciones menores de 1 gL⁻¹, de agar es determinante para inducir vitrificación (formación de hojas suculentas y frágiles) durante la fase II de la micropropagación.
Merck ha elaborado gelrite (phytagel), que a pesar de ser más caro que el agar agar, tienen la ventaja de emplearse en cantidades menores (0.5 - 2.0g), lo que ha motivado que muchos laboratorios lo estan usando. Además, tiene la característica de que al enfriarse es transparente, aspecto importante para la observación del inóculo, durante la micropropagación.
Existen otras opciones de agentes solidificantes, pero algunos por sus características físicas, no endurecen o hierven a las temperaturas que se requieren para su empleo en el cultivo de tejidos, por ejemplo: La gelatina tiene su punto de ebullición a 25°C, aproximadamente. Para el caso del cultivo de protoplastos, algunos autores han empleado alginatos que aunque tiene las ventajas de formar gel cuando se adiciona o se licua por la presencia de algún agente quelante o citrato de sodio. Presenta desventajas, como ser altamente termoinestable con los cationes bivalentes, ocasionado una eliminación de nutrientes (Button y Botha, 1975).
Sin embargo, Sigma sabiendo que el agar puede tener algún efecto sobre el crecimiento del tejido in vitro, ha desarrollado diferentes tipos de agentes solidificantes buscando proporcionar un mayor número de opciones que se adapten a las necesidades del investigador, investigaciones o especies vegetales. Estos productos se caracterizan por tener diferentes grados de pureza y costos, importantes factores en cualquier investigación u operación de producción.
REFERENCIAS
APUNTES TOMADOS DE:
PUCHE A., F. Y RODRIGUEZ P., L. 2000. CURSO-TALLER CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES. ITA-25-DGETA. MEXICO. 152P
